ÉTUDE DE L'ACTIVITÉ DE LA TYROSINASE
DU CHAMPIGNON DE PARIS PAR COLORIMÉTRIE

Danielle Pichon, lycée Montgrand, Marseille
Yolande Faure, professeur honoraire

L'étude quantitative, par EXAO, de la catalyse enzymatique utilise le plus souvent l'oxymètre (catalase, glucose-oxydase, par exemple). Avec la tyrosinase, on pratique une autre approche de l'étude de l'activité enzymatique, car les réactions qu'elle catalyse produisent des substances colorées : l'étude se fera par colorimétrie.

De plus, l'étude de cette enzyme permet :

- de mieux interpréter certains phénomènes d'observation courante (après les avoir coupés, le champignon de Paris et la pomme de terre noircissent) ;
- de faire des liens avec certains aspects du métabolisme (elle intervient dans la synthèse de certains neurotransmetteurs et hormones) ou avec l'expression phénotypique des gènes (elle intervient dans la synthèse des mélanines).

Enfin, on peut trouver un autre intérêt à cette étude car de nombreuses enzymes catalysant des réactions colorées sont utilisées dans des tests de dépistage et de dosage mis à la disposition des consommateurs.

Toutes les expériences et mesures ont été faites avec le colorimètre COLOR 4 et le logiciel ENZYMO 2.1 de la société Jeulin, en suivant quelques indications fournies par cette société.

1. QUELQUES INFORMATIONS SUR LA TYROSINASE

Le nom officiel d'une enzyme comporte le type de réaction catalysée, le nom des substrats impliqués et éventuellement d'autres informations codées. La tyrosinase appartient au groupe des enzymes oxydo-réductases, son nom est : monophénol, orthodiphénol : oxygène réductase. On l'appelle aussi tyrosine hydroxylase.

Comme de nombreuses enzymes d'oxydo-réduction, elle présente en son site actif l'ion cuivre, et nécessite pour fonctionner le NADP réduit.

Elle catalyse les réactions suivantes :

On voit qu'au cours de la réaction du dioxygène est consommé, d'où l'utilisation d'anti-oxygène pour la conservation de certains aliments.

La formation des mélanines peut être observée si les produits de la réaction sont conservés et cela d'autant plus vite qu'ils sont maintenus au voisinage de 30 °C. Le détail des réactions est donné dans la figure 1.

Fig. 1 : Principales étapes de la formation des mélanines

2. PRÉPARATION DE L'EXTRAIT ENZYMATIQUE

Broyer des champignons jeunes ; mélanger à un poids égal d'eau distillée, par exemple 100 g de champignons dans 100 mL d'eau ; filtrer.

Le filtrat contient l'enzyme ; il peut être conservé plus de 48 heures au réfrigérateur et beaucoup plus longtemps au congélateur.

Remarque - Il existe de la tyrosinase dans le commerce, mais elle est coûteuse et difficile à dissoudre.

3. PRÉPARATION DES SOLUTIONS DE TYROSINE (TYROSINE DU COMMERCE)

Solution de base (1g.L^-1) : elle est très longue à réaliser car la tyrosine se dissout mal. Un agitateur magnétique et un léger chauffage sont nécessaires ; ce dernier entraîne une floculation qu'on élimine en filtrant ; on ne connaît donc pas la concentration exacte de la solution de base.

Solutions utilisées : faire 4 solutions très diluées pour se situer dans les limites de la loi de Beer-Lambert (concentration inférieure à 10^-2 M.L^-1). Si on utilise des concentrations supérieures, on obtient des résultats aberrants. Les concentrations sont les suivantes : 0,05 ‰, 0,025 ‰ , 0,0125 ‰ et 0,00625 ‰ de la solution de base filtrée.

4. ÉTUDE DE L'INFLUENCE DE LA [S] SUR L'ACTIVITÉ DE LA TYROSINASE

Toutes les mesures sont faites en utilisant la lumière monochromatique de 470 nm de longueur d'onde.

4.1. Avec le module "transmission et cinétique" du logiciel

4.1.1. Mode opératoire :

Régler le 100 % de transmission avec la solution de base de tyrosine. Choisir une durée d'acquisition de 6 ou 7 min. Choisir le mode échelonné. Préparer les quatre cuves en introduisant 3 mL de substrat dans chacune d'entre elles :

- dans la cuve 1 : substrat à 0,05 ‰
- dans la cuve 2 : substrat à 0,025 ‰
- dans la cuve 3 : substrat à 0,0125 ‰
- dans la cuve 4 : substrat à 0,00625 ‰

Introduire 0,3 mL d'enzyme dans la cuve 1, agiter, placer la cuve dans le colorimètre, poser le capuchon, taper sur une touche quelconque et sur la barre espace.

Faire de même avec les cuves 2, 3, et 4.

4.1.2. Résultats

Les résultats obtenus sont figurés ci-dessous :

Fig. 2 : Exemple de résultat en transmission

Fig. 3 : La même expérience, affichée en cinétique

Remarques - En transmission, le début de l'enregistrement est très souvent confus. En cinétique, on peut faire calculer par le logiciel la pente des courbes, c'est-à-dire la vitesse initiale de la réaction enzymatique. Elle s'exprime en quantité de produit formé (u.a.) par min. L'élève peut alors tracer la courbe Vi = f([S]).

4.2. Avec le module "études expérimentales"

Le mode opératoire est le même que précédemment, mais seule la cinétique s'affiche (voir figure 4).

Fig. 4 : Affichage en cinétique avec le module "études expérimentales"

On peut obtenir, en fin d'expérience, la courbe Vi =f ([S]) (voir figure 5). Pour cela il faut renseigner le logiciel sur les concentrations en substrat dans chaque cuve ; on a inscrit celles-ci sous la forme : 100, 50, 25, 12 ou 13 (on ne peut pas écrire 12,5).

Fig. 5 : Les points calculés et affichés par le logiciel pour la courbe Vi =f ([S])

5. UTILISATION DE L'HYDROQUINONE COMME SUBSTRAT

La formule de l'hydroquinone est la suivante :

La tyrosinase transforme également l'hydroquinone (voir figure 6).

Fig. 6 : Comparaison de l'action de la tyrosinase sur la tyrosine et l'hydroquinone

L'hydroquinone se transforme spontanément en présence d'oxygène en produit coloré, mais plus lentement que sous l'action de la tyrosinase ; on peut ainsi voir l'intérêt des enzymes pour catalyser les réactions métaboliques.

6. INHIBITION DE LA TYROSINASE PAR UN CHÉLATEUR DU CUIVRE

Comme tous les chélateurs, le phénylthiocarbamide (PTC) capte fortement un métal, ici le cuivre. Il empêche la tyrosinase d'agir car ce métal, situé au niveau du site actif de l'enzyme, est essentiel à son fonctionnement.

Le PTC, très toxique, est à manipuler avec précaution ; on utilise une solution saturée (0,03 g de PTC dans 10mL d'eau distillée).

Pour réaliser cette expérience, on peut procéder comme au paragraphe 4.1. On remplit les cuves 1 et 2 avec 3 mL de tyrosine à 0,05 ‰ et les cuves 3 et 4 avec la même quantité de tyrosine à 0,0125 ‰. On lance la mesure. Après quelques minutes, on introduit 0,2 mL de solution de PTC dans les cuves 3 et 4 (voir figure 7).

Fig. 7 : Action de la PCT

Remarque - Pour éviter les perturbations visibles sur les enregistrements, dues à l'ouverture des cuves, on peut réaliser un petit trou dans les capuchons des cuves pour le passage du cathéter.

On pourra poursuivre cette étude en faisant varier les conditions expérimentales : température, pH, etc.
Le matériel biologique utilisé est facile à obtenir et à conserver.

BIBLIOGRAPHIE

MERCIER P. - Les mélanocytes sortent de l'ombre, in Biofutur n° 114, 1992
PELMONT J. - Enzymes, Presses universitaires de Grenoble, 1989
WEIL J.-H. - Biochimie générale, Masson, 1994